Precedenti capitoli:
Di ciò che non è stato detto... (13/1)
Prosegue da...:
Un mercato all'altro (15)
....Indossava
un respiratore purificatore d'aria in polvere (3M traspirare facilmente) con
tute, grembiuli, stivaletti in Tyvek ed era a doppio guanto.
Clustering
di sequenze e modellazione strutturale
Le
sequenze del genoma a lunghezza intera e i domini S1 delle sequenze di
aminoacidi a spillo di CoV rappresentativi sono stati scaricati da Genbank o
PATRIC, allineati con ClustalX e confrontati filogeneticamente da Maximum
Likelihood usando 100 bootstrap o rispettivamente con il pacchetto PhyML.
L'albero è stato generato utilizzando la massima verosimiglianza con il
pacchetto PhyML. La barra della scala rappresenta le sostituzioni
nucleotidiche. Solo i nodi con supporto bootstrap superiore al 70% sono
etichettati. L'albero mostra che i CoV sono divisi in tre distinti gruppi
filogenetici definiti come α, β e γ. I cluster di sottogruppi classici sono
contrassegnati come 2a – 2d per i CoV β e 1a e 1b per i CoV α. I modelli
strutturali sono stati generati utilizzando Modeller (Max Planck Institute
Bioinformatics Toolkit) per generare modelli di omologia per SHC014 e Rs3367
del SARS RBD in complesso con ACE2 basato sulla struttura cristallina 2AJF
(identificatore PBD RCSB). I modelli di omologia sono stati visualizzati e
manipolati in MacPyMol (versione 1.3).
Costruzione
di virus chimerici SL
Sia i
virus wild-type che quelli chimerici sono stati derivati dal SARS-CoV Urbani o dal clone infettivo adattato per topo
corrispondente (MA15) come precedentemente descritto. I plasmidi contenenti
sequenze di picchi per SHC014 sono stati estratti mediante digestione di
restrizione e legati nel plasmide E ed F del clone infettivo MA15. Il clone è
stato progettato e acquistato da Bio Basic come sei cDNA contigui utilizzando
sequenze pubblicate affiancate da siti unici di endonucleasi di restrizione di
classe II (BglI). Successivamente, i plasmidi contenenti frammenti di genoma SARS-CoV
di tipo chimerico, chimerico e SHC014-CoV sono stati amplificati, escisi,
ligati e purificati. Le reazioni di trascrizione in vitro sono state quindi
preformate per sintetizzare l'RNA genomico a lunghezza intera, che è stato
trasfettato nelle cellule Vero E6 come precedentemente descritto 28. I media
provenienti da cellule trasfettate sono stati raccolti e serviti come scorte di
semi per esperimenti successivi. I virus chimerici e full-length sono stati
confermati dall'analisi della sequenza prima dell'uso in questi studi. La
costruzione sintetica del mutante chimerico e della SHC014-CoV a lunghezza
intera sono state approvate dal Comitato istituzionale per la biosicurezza
dell'Università del Nord Carolina e dal Comitato per la ricerca sull'uso del doppio
uso.
Dichiarazione
etica
Questo
studio è stato condotto in conformità con le raccomandazioni per la cura e
l'uso degli animali da parte dell'Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW),
National Institutes of Health. Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso
degli animali (IACUC) dell'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill
(UNC, permesso numero A-3410-01) ha approvato il protocollo di studio sugli
animali (IACUC n. 13-033) seguito in questo manoscritto.
Topi e
infezione in vivo
Topi
femmina Balb / cAnNHsD di 10 settimane e 12 mesi sono stati ordinati dagli
Harlan Labs. Le infezioni da topo si sono verificate come precedentemente
descritto 29. In breve, gli animali sono stati portati in un laboratorio di
biosicurezza di livello 3 e lasciato acclimatarsi per 1 settimana prima
dell'infezione. Per l'infezione e la vaccinazione virale attenuata dal vivo, i
topi sono stati anestetizzati con una miscela di ketamina e xilazina e
infettati per via intranasale quando sottoposti a sfida con 50 μl di soluzione
salina tamponata con fosfato (PBS) o virus diluito con 3-4 topi per volta, per
gruppo di infezione per dose come descritto nella figura legende. Per i topi
individuali, le notazioni di infezione tra cui la mancata inalazione
dell'intera dose, il gorgoglio dell'inoculo dal naso o l'infezione attraverso
la bocca possono portare all'esclusione dei dati del topo a discrezione del
ricercatore; post-infezione, non sono definiti altri criteri di esclusione /
inclusione prestabiliti. Nessun accecamento è stato usato in nessun esperimento
su animali e gli animali non sono stati randomizzati. Per la vaccinazione, topi
giovani e anziani sono stati vaccinati mediante iniezione del footpad con un
volume di 20 μl di 0,2 μg di vaccino SARS-CoV a doppia inattivazione con allume
o PBS finto; i topi sono stati quindi potenziati con lo stesso regime 22 giorni
dopo e successivamente sfidati 21 giorni. Per tutti i gruppi, come da
protocollo, gli animali sono stati monitorati quotidianamente per rilevare
segni clinici di malattia (ingobbimento, pelo arruffato, attività ridotta) per
la durata dell'esperimento. La perdita di peso è stata monitorata
quotidianamente per i primi 7 giorni, dopodiché il monitoraggio del peso è
continuato fino a quando gli animali non hanno recuperato il loro peso iniziale
iniziale o visualizzato tre giorni continui di aumento di peso. Tutti i topi
che hanno perso oltre il 20% del loro peso corporeo iniziale sono stati nutriti
a terra e monitorati ulteriormente più volte al giorno, purché fossero sotto il
limite del 20%. I topi che hanno perso più del 30% del loro peso corporeo
iniziale sono stati immediatamente sacrificati secondo il protocollo. Qualsiasi
topo ritenuto moribondo o improbabile da recuperare è stato anche sacrificato
umanamente a discrezione del ricercatore. L'eutanasia è stata preformata
mediante sovradosaggio di isoflurano e conferma della morte per lussazione
cervicale. Tutti gli studi sui topi sono stati condotti presso l'Università
della Carolina del Nord (Animal Welfare Assurance n. A3410-01) utilizzando
protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli
animali dell'UNC (IACUC).
Analisi
istologica
Il
polmone sinistro è stato rimosso e immerso in formalina tamponata al 10%
(Fisher) senza inflazione per 1 settimana. I tessuti sono stati incorporati
nella paraffina e le sezioni di 5 μm sono state preparate dalla struttura
centrale di istopatologia del Centro per il cancro globale Lineberger dell'UNC.
Per determinare l'estensione della colorazione dell'antigene, le sezioni sono
state colorate per l'antigene virale usando un anticorpo policlonale SARS-CoV
anti-nucleocapside disponibile in commercio (Imgenex) e marcato in modo cieco
per la colorazione delle vie aeree e del parenchima come precedentemente descritto.
Le immagini sono state catturate utilizzando un microscopio Olympus BX41 con
una fotocamera Olympus DP71.
Saggi
di neutralizzazione dei virus
I
saggi del titolo di neutralizzazione della riduzione della placca sono stati
eseguiti con anticorpi precedentemente caratterizzati contro SARS-CoV come
precedentemente descritto. In breve, nAbs o siero sono stati diluiti in serie 2
volte e incubati con 100 PFU dei diversi ceppi icSARS-CoV per 1 ora a 37 ° C.
Il virus e gli anticorpi sono stati quindi aggiunti a una piastra da 6 pozzetti
con 5 × 10 5 Vero E6 cellule / pozzetto con N ≥ 2. Dopo un'incubazione di 1 ora
a 37 ° C, le cellule sono state sovrapposte con 3 ml di agarosio allo 0,8% in
media. Le piastre sono state incubate per due giorni a 37 ° C e quindi colorate
con rosso neutro per 3 ore e sono state contate le placche. La percentuale di
riduzione della placca è stata calcolata come [1 - (n. Di placche con anticorpo
/ n. Di placche senza anticorpo)] × 100.
Analisi
statistica
Tutti
gli esperimenti sono stati condotti contrastando due gruppi sperimentali (due
virus o coorti vaccinati e non vaccinati). Pertanto, differenze significative
nel titolo virale e nel punteggio istologico sono state determinate dal test t
di uno studente a due code in singoli punti temporali. I dati venivano
normalmente distribuiti in ciascun gruppo confrontato e presentavano una
varianza simile.
Biosicurezza
Sono
stati avviati studi segnalati dopo che il Comitato istituzionale per la
biosicurezza dell'Università del Nord Carolina ha approvato il protocollo
sperimentale: Titolo del progetto: Generazione di cloni infettivi di COV simili
a pipistrelli SARS; ID del piano di sicurezza del laboratorio: 20145741;
Programma G ID: 12279. Questi studi sono stati avviati prima della pausa del
finanziamento della ricerca sui processi deliberativi del governo degli Stati
Uniti su un guadagno selezionato della ricerca funzionale che coinvolge virus
influenzali, MERS e SARS (http://www.phe.gov/s3/dualuse/Documents
ain-of-function.pdf) e l'attuale manoscritto è stato rivisto dall'agenzia di
finanziamento, il National Institutes of Health (NIH). Il proseguimento di
questi studi è stato richiesto e approvato da NIH.
Tutto
il lavoro per questi studi è stato eseguito con procedure operative standard
approvate (SOP) e condizioni di sicurezza per SARS-CoV, MERs-CoV e altri CoV
correlati. Le nostre strutture istituzionali BSL3 CoV sono state progettate per
conformarsi ai requisiti di sicurezza raccomandati in Biosicurezza nei
laboratori di microbiologia e biomedicale (BMBL), Dipartimento di salute e
servizi umani degli Stati Uniti, Servizio di sanità pubblica, Centri per il
controllo delle malattie (CDC) e NIH. Sono stati presentati piani di sicurezza
di laboratorio e la struttura è stata approvata per l'uso dal Dipartimento di
salute e sicurezza ambientale (EHS) e dal CDC. L'accesso alla scheda elettronica
è necessario per l'ingresso nella struttura. Tutti i lavoratori sono stati
formati da EHS per utilizzare in modo sicuro respiratori ad aria purificata
(PAPR), e sono in atto adeguate abitudini di lavoro in una struttura BSL3 e
piani di sorveglianza medica attiva. Le nostre strutture CoL BSL3 contengono
ventole ridondanti, alimentazione di emergenza per ventilatori, armadi e
congelatori biologici di sicurezza e possono ospitare rack per mouse SealSafe.
I materiali classificati come agenti BSL3 saranno costituiti da SARS-CoV, ceppi
precursori di CoV di pipistrello, MERS-CoV e mutanti derivati da questi agenti patogeni. All'interno delle strutture
BSL3, la sperimentazione con virus infettivi verrà eseguita in un armadio di biosicurezza di classe II (BSC)
certificato. Tutto il personale indossa scrub, PAPR, tute e grembiuli tyvek,
copriscarpe e mani con doppio guanto. Gli utenti di BSL3 sono soggetti a un
piano di sorveglianza medica monitorato dalla Clinica per la salute sul lavoro
dei dipendenti delle università (UEOHC), che comprende una vaccinazione fisica
annuale e annuale contro l'influenza, e la segnalazione obbligatoria di
eventuali sintomi associati all'infezione da CoV durante i periodi in cui si
lavora in BSL3. Tutti gli utenti di BSL3 sono addestrati nella gestione
dell'esposizione e nei protocolli di segnalazione, sono preparati
all'auto-quarantena e sono stati addestrati per la consegna sicura a un
dipartimento locale di gestione delle malattie infettive in una situazione di
emergenza. Tutti i potenziali eventi di esposizione sono segnalati e indagati
da EHS e UEOHC, con segnalazioni presentate sia al CDC che al NIH.
Ringraziamenti
La
ricerca in questo manoscritto è stata supportata da sovvenzioni dell'Istituto
nazionale di allergia e malattie infettive e dell'Istituto nazionale di
invecchiamento del National Institutes of Health (NIH) con i premi U19AI109761
(RSB), U19AI107810 (RSB), AI1085524 (WM), F32AI252561 (VDM), K99AG049092 (VDM);
e National Natural Science Foundation of China Award 81290341 (ZLS) e 31470260
(XYG). Le culture epiteliali delle vie aeree umane sono state supportate dal
National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Disease con il premio
NIH DK065988(SHR). Gli autori riconoscono anche MT Ferris, Dipartimento di
Genetica, Università della Carolina del Nord per la revisione degli approcci
statistici e CT Tseng, Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, Università
del Texas Medical Branch per la fornitura di cellule Calu3. Esperimenti con
virus ricombinanti SHC014 a lunghezza intera e chimerici sono stati avviati ed
eseguiti prima del guadagno della pausa di finanziamento della ricerca di
funzioni e da allora sono stati rivisti e approvati per lo studio continuo da
NIH. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta
necessariamente le opinioni ufficiali del NIH.
Contributi
dell'autore
VDM ha
progettato, coordinato, eseguito esperimenti, completato analisi e scritto il
manoscritto. BLY ha progettato un clone infettivo e recuperato virus chimerici.
SA ha completato i test di neutralizzazione. LEG ha aiutato a eseguire
esperimenti con il mouse, TS e JAP hanno completato esperimenti con il mouse e
test sulla placca. XG ha eseguito esperimenti di pseudotipizzazione. KD ha
generato cifre e previsioni strutturali. Analisi filogenetica generata da ED.
RLG ha completato l'analisi dell'RNA. SHR ha fornito colture epiteliali
primarie per le vie respiratorie umane. AL e WM hanno fornito reagenti
anticorpali monoclonali critici. ZLS ha fornito sequenze di picchi e plasmidi
SHC014. RSB ha progettato esperimenti e scritto manoscritti. Gli autori non
dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Nello studio, infatti, si descrive la creazione di un nuovo virus
ottenuto combinando il coronavirus scoperto in una particolare specie di
pipistrello cinese con un altro che causa la Sars nei topi da laboratorio. Roba
che, già all’epoca, fece esplodere una furente polemica in seno alla comunità
scientifica mondiale, tanto che Nature dedicò ampio spazio al dibattito fra
scienziati e riportò l’allarme di moltissimi esperti rispetto ai rischi che
esperimenti simili possono comportare per la sicurezza e la salute pubblica:
Un
esperimento che ha creato una versione ibrida di un coronavirus di pipistrello
- uno correlato al virus che causa la SARS (sindrome respiratoria acuta grave)
- ha innescato un rinnovato dibattito sull'opportunità di valere i rischi in
caso di ingegneria di varianti di virus con possibile potenziale pandemico.
In un
articolo pubblicato su Nature Medicine il 9 novembre, gli scienziati hanno
studiato un virus chiamato SHC014, che si trova nei pipistrelli a ferro di
cavallo in Cina. I ricercatori hanno creato un virus chimerico, costituito da
una proteina di superficie di SHC014 e dalla spina dorsale di un virus SARS che
era stato adattato per crescere nei topi e imitare le malattie umane. La
chimera ha infettato le cellule delle vie aeree umane, dimostrando che la
proteina di superficie di SHC014 ha la struttura necessaria per legarsi a un
recettore chiave sulle cellule e infettarle. Inoltre ha causato malattie nei
topi, ma non li ha uccisi.
Sebbene
quasi tutti i coronavirus isolati dai pipistrelli non siano stati in grado di
legarsi al recettore umano chiave, SHC014 non è il primo a poterlo fare. Nel
2013, i ricercatori hanno riportato questa capacità per la prima volta in un
diverso coronavirus isolato dalla stessa popolazione di pipistrelli.
I
risultati rafforzano i sospetti che i coronavirus di pipistrello in grado di
infettare direttamente gli umani (piuttosto che prima necessitare di evolversi
in un ospite animale intermedio) possano essere più comuni di quanto si
pensasse in precedenza, affermano i ricercatori.
Ma
altri virologi si chiedono se le informazioni raccolte dall'esperimento
giustifichino il rischio potenziale. Sebbene l'entità di ogni rischio sia
difficile da valutare, Simon Wain-Hobson, un virologo del Pasteur Institute di
Parigi, sottolinea che i ricercatori hanno creato un nuovo virus che
"cresce notevolmente" nelle cellule umane. "Se il virus fosse
fuggito, nessuno avrebbe potuto prevedere la traiettoria", afferma.
Creazione
di una chimera
L'argomentazione
è essenzialmente una ripetizione del dibattito sull'opportunità di consentire
ricerche di laboratorio che aumentino la virulenza, la facilità di diffusione o
la gamma di agenti patogeni pericolosi - ciò che è noto come ricerca
"guadagno di funzione". Nell'ottobre 2014, il governo degli Stati
Uniti ha imposto una moratoria sul finanziamento federale di tali ricerche sui
virus che causano SARS, influenza e MERS (sindrome respiratoria del Medio
Oriente, una malattia mortale causata da un virus che salta sporadicamente dai
cammelli alle persone).
L'ultimo
studio era già in corso prima dell'inizio della moratoria americana e il
National Institutes of Health (NIH) degli Stati Uniti gli ha permesso di
procedere mentre era in fase di revisione da parte dell'agenzia, afferma Ralph
Baric, ricercatore di malattie infettive all'Università del Nord Carolina a
Chapel Hill, coautore dello studio. Il NIH alla fine ha concluso che il lavoro
non era così rischioso da cadere sotto la moratoria, dice.
Ma
Wain-Hobson non approva lo studio perché, dice, fornisce pochi benefici e
rivela poco sul rischio che il virus SHC014 selvaggio nei pipistrelli pone agli
umani.
Altri
esperimenti nello studio mostrano che il virus nei pipistrelli selvatici
dovrebbe evolversi per rappresentare una minaccia per l'uomo - un cambiamento
che potrebbe non accadere mai, sebbene non possa essere escluso. Baric e il suo
team hanno ricostruito il virus selvaggio dalla sua sequenza genomica e hanno
scoperto che è cresciuto male nelle colture cellulari umane e non ha causato
alcuna malattia significativa nei topi.
"L'unico
impatto di questo lavoro è la creazione, in un laboratorio, di un nuovo rischio
non naturale", concorda Richard Ebright, biologo molecolare ed esperto di
biodefence alla Rutgers University di Piscataway, New Jersey. Sia Ebright che
Wain-Hobson sono critici di lunga data della ricerca di guadagno di funzione.
Nel
loro articolo, gli autori dello studio ammettono anche che i finanziatori
potrebbero pensare due volte a consentire tali esperimenti in futuro. "I
gruppi di revisione scientifica possono ritenere che studi simili costruiscano
virus chimerici basati su ceppi circolanti troppo rischiosi da
perseguire", scrivono, aggiungendo che è necessaria una discussione sul
"se questi tipi di studi sui virus chimerici giustificano ulteriori
indagini rispetto ai rischi intrinseci".
Ma
Baric e altri affermano che la ricerca ha avuto benefici. I risultati dello
studio "spostano questo virus da un candidato patogeno emergente a un
pericolo chiaro e presente", afferma Peter Daszak, che è stato coautore
del documento del 2013. Daszak è presidente dell'EcoHealth Alliance, una rete
internazionale di scienziati, con sede a New York City, che campiona virus
provenienti da animali e persone nei punti di crisi delle malattie emergenti in
tutto il mondo.
Daszak
concorda che gli studi che testano i virus ibridi nella coltura cellulare umana
e i modelli animali sono limitati in ciò che possono dire sulla minaccia
rappresentata da un virus selvaggio. Ma sostiene che possono aiutare a indicare
a quali agenti patogeni dovrebbe essere data la priorità per ulteriore attenzione
della ricerca.
Senza
gli esperimenti, afferma Baric, il virus SHC014 sarebbe ancora visto come una
minaccia. In precedenza, gli scienziati avevano creduto, sulla base della
modellistica molecolare e di altri studi, che non avrebbe dovuto essere in
grado di infettare le cellule umane. L'ultimo lavoro mostra che il virus ha già
superato le barriere critiche, come la capacità di agganciarsi ai recettori
umani e infettare in modo efficiente le cellule delle vie aeree umane, dice.
"Non credo che tu possa ignorarlo." Ha in programma di fare ulteriori
studi con il virus nei primati non umani, che potrebbero fornire dati più
rilevanti per l'uomo.
Una, di fatto, la domanda che scaturiva: ne vale la pena?
La pensava così, ad esempio, il dottor Simon Wain-Hobson, virologo
presso l’Istituto Pasteur di Parigi, a detta del quale non solo “occorrerebbe
chiedersi seriamente se le informazioni che possiamo ricavare da studi simili
valgano il rischio che potenzialmente portano con sé” ma, soprattutto,
“se ci fosse una fuga di quel virus, anche minima, nessuno potrebbe
predirne la traiettoria”.
Ancora più netto il giudizio del professor Richard Ebright, biologo
molecolare ed esperto di biodifesa alla Rutgers University, in New Jersey:
“L’unico impatto concreto che otteniamo da questo lavoro è la
creazione, in laboratorio, di un nuovo rischio non naturale”.
E proprio quella definizione – “non-naturale” – oggi apre varchi
enormi a scenari formalmente complottistici ma che, nelle ultime ore, sono
sbarcati anche nel dibattito politico Usa al più alto livello, dopo che il
senatore repubblicano dell’Arkansas, Tom Cotton, ha chiesto ufficialmente che
il governo statunitense ottenga da quello cinese la certificazione della natura
non di bio-arma del coronavirus.
Al centro dell’accusa, la presenza a Wuhan, epicentro della crisi,
del famoso laboratorio di massima sicurezza – classificato P4, l’unico del
genere in Cina – in cui, a detta di un reportage sempre della rivista Nature
del febbraio 2017, vengono studiati gli agenti patogeni più pericolosi al
mondo.
E proprio in quel laboratorio oggi lavora, dopo anni nei principali
laboratori degli Stati Uniti, una delle ricercatrici che ha partecipato allo
studio della discordia, la dottoressa Shi Zhengli, affiancata all’epoca nel
team anche da un altro virologo cinese, Xing-Yi Ge, anch’egli con anni di
esperienza sul campo negli Usa.
Ed ecco che, come mostra questa immagine, non più tardi dello scorso
20 gennaio, sempre su Nature, la dottoressa Shi Zhengli appare fra le firme di
un articolo nel quale si conferma la natura di mutazione animale del virus e la
diretta responsabilità del pipistrello cinese.
Insomma, lungi dal voler garantire patenti di agibilità a tesi
complottiste degne del Napalm 51 di Maurizio Crozza, forse maggiore chiarezza e
trasparenza da parte del governo cinese sull’intera genesi della faccenda
sarebbe stata di aiuto proprio allo scongiurare del diffondersi di dietrologie
parallele o teorie millenaristiche.
Anche perché, stando alla denuncia di alcuni organi di stampa cinesi,
dopo la rimozione dei responsabili sanitari della provincia di Hubei,
tramutatisi come nella miglior tradizione del Dragone in Monsieur Malaussène
della pandemia, ora a capo dell’autorità sanitaria dell’area-epicentro sarebbe
stata inviata dal governo centrale la general maggiore Chen Wei, massimo
esperto nazionale di armi biochimiche per la difesa. Il suo quartier generale?
Il laboratorio P4 di Wuhan, attorniata unicamente da personale
militare.
Vero? Falso? Per ora, decisamente verosimile, almeno stando alla non
smentita di Pechino. Le ombre, comunque, restano. Non fosse altro per quel
balzo ad orologeria e al rialzo nella contabilità dei contagiati.
(Fonti: Nature Medicina 12 Nov. 2015;
National Center for Biotechnology Information; Mauro Bottarelli)
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